【CEM】宠物食品中牛磺酸含量的快速制备

一、引言

宠物通常被视为我们直系家庭中毛茸茸的（有鳞、有羽毛等）成员，在现代生活中扮演着重要角色。宠物用品从加热床到专业美容服务应有尽侑，因此它们的饮食受到更严格的审查也就不足为奇了。狗粮形式多样，不同食谱对健康有益也有风险。近来，无谷物或富含豆类的饮食因其与犬类心脏病——扩张型心肌病（DM）之间的联系而受到质疑，这种疾病可导致充血性心力衰竭，最终可能导致死亡。DM是由于缺乏牛磺酸引起的，因此狗的饮食必须含有足量的牛磺酸。

在本研究中，使用Discover Prep™系统水解狗粮样本，以将氨基酸从其结合的蛋白质中释放出来。与传统的水解技术相比，Discover Prep利用微波进行样本水解，将技术的时间框架从24小时缩短至不到一小时。水解后，样本被中和，并使用Waters AccQ-Tag®试剂盒测量氨基酸含量。结果表明，与传统方法相比，Discover Prep能够迅速且准确地从宠物食品中的蛋白质水解出牛磺酸，具有很好的精确度。无谷物狗粮和含谷物狗粮样本的牛磺酸含量进行了比较。对于实验室量化狗粮中的牛磺酸和其他氨基酸而言，Discover Prep是一个理想的选择。

二、材料与方法

试剂和样品

所有试剂均购自商业供应商。所有狗粮样品均从当地宠物用品店购买。所有狗粮样品均使用商用厨房搅拌机研磨。选择这些狗粮是因为它们的主要蛋白质成分不同，并且标称含有高含量的牛磺酸。分析了三个样品：样品1是三文鱼、红薯和南瓜配方，样品2是鸡肉和红薯配方，样品3是火鸡和燕麦配方。水解溶液在使用前新鲜制备。

狗粮样品使用CEM Discover Prep系统进行水解。通过柱前衍生化测定水解产物的氨基酸含量，然后通过UPLC^®注射和在260 nm下的PDA检测进行分析。使用Waters AccQ-Tag Ultra衍生化试剂盒对水解产物进行LC-PDA分析。Discover Prep样品制备的结果与传统烤箱法及营养标签进行了比较。

Discover Prep样品制备

将100毫克狗粮样品加入装有搅拌棒的35 mL Discover Pyrex^®小瓶中。记录质量以供分析。对于酸性水解，向每个小瓶中加入5毫升含1%苯酚的6 N HCl。所有小瓶用N₂吹扫1分钟，然后迅速盖上盖子。样品按以下Discover Prep方法运行：

酸性水解

小瓶类型：Pyrex

控制类型：动态

温度：160 °C

时间：30分钟

压力：300 PSI

功率：300 W

搅拌：高

传统水解样品制备

将40毫克狗粮样品加入适当的玻璃小瓶中。记录质量以供分析。对于酸性水解，向每个小瓶中加入2毫升含1%苯酚的6 N HCl。所有小瓶用N₂吹扫1分钟，然后迅速盖上盖子。然后将小瓶放入设定为110 °C的空气烘箱中24小时。

水解后样品制备和衍生化分析

酸性水解样品用6 N NaOH中和，并用0.26 µm PTFE注射器过滤器过滤。中和后，样品用Waters AccQ-Tag试剂盒进行衍生化。向一个完整的回收小瓶中加入80 µL来自Waters AccQ-Tag Ultra衍生化试剂盒的硼酸缓冲液。然后，加入10 µL样品并盖紧盖子涡旋。接着，向每个样品反应中加入10 µL准备好的衍生化试剂。最后，将反应涡旋10秒钟，然后在55 °C下加热10分钟进行分析。

分析

每个衍生化反应取1 μL样品注入Waters AccQ-Tag Ultra C18柱（1.7 μm, 2.1 x 100 mm），该柱连接到带有Waters PDA检测器的Waters ACQUITY™ H-Class UPLC^®。流速设定为0.4 mL/min。柱温保持在55 °C，吸收波长监测在260 nm。用于分离的洗脱梯度如表1所示。流动相为A: Milli-Q^®水中稀释10倍的Waters AccQ-Tag洗脱液A和B: Waters AccQ-Tag洗脱液B。为了每种氨基酸创建校准曲线，使用Waters Amino Acid Food and Feed Standard Kit（Waters Corporation, SKU. 186009299）进行衍生化，浓度分别为1, 5, 10, 25, 和50 pmol/μL。采用线性回归法分析样品。

表1. 衍生化氨基酸分离所用梯度

三、结果

图1. Discover Prep水解中回收的牛磺酸量

图2. 从狗粮中回收的氨基酸量

四、结论

Discover Prep微波反应系统成功水解了宠物食品中的氨基酸，并产生了与传统烘箱水解相似的结果。在比较氨基酸含量时，传统烘箱水解和Discover水解的结果%RSD均小于10%。在比较狗粮的牛磺酸含量时，样品1的含量最高，其次是样品2和样品3。